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还原型谷胱甘肽的测定实验

2017/6/19      点击:79
   还原型谷胱甘肽的测定实验
  谷胱甘肽(glutathiose,r-glutamyl cysteingl +glycine,GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽,由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞。
  实验方法
  双抗夹心ELISA法
  免疫组织法
  实验方法原理 先将康体包被于反应板上,加入待测抗原,然后再加入酶标康体,显色后即可测得抗原含量。
  实验材料 抗体
  试剂、试剂盒 碳酸盐缓冲液 Na2CO3 磷酸盐缓冲液 NaCl KCl TMB 二甲基亚砜 牛血清蛋白
  仪器、耗材 酶标仪 培养箱
  还原型谷胱甘肽实验步骤
  一、材料准备
  1.  包被液:0.05 mol/l(pH9.6)碳酸盐缓冲液:Na2CO3 0.159 g,NaHCO3 0.294 g,用蒸馏水溶解后,定容至100 ml。
  2.  PBS-T洗涤液:0.01mol/ pH7.4磷酸盐-氯化钠缓冲液:NaCl 8.0 g,KH2PO4 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 2.9 g,KCl 0.2 g,吐温-20 0.5 ml,用蒸馏水溶解后,定容至1000 ml。
  3.  底物溶液3,3’,5,5‘-四甲基联苯胺(TMB)贮存液及应用液:
  (1)0.1 mol/l pH6.8 PBS:Na2HPO4·12H2O 1.09 g,NaH2PO4·H2O 6.05 g,蒸馏水溶解后定容至500 ml,4℃保存备用。
  (2)TMB贮备液:TMB 60 mg 溶于10 ml 二甲基亚砜(DMSO)中4℃保存备用。
  (3)TMB应用液:临用前取0.1 mol/l pH6.0 PBS 10 ml,TMB贮备液100 ul,30%H2O2 15 ul 混匀即可。
  二、还原型谷胱甘肽实验步骤
  1.  抗体包被
  (1)抗体用包被液稀释至20 ug/ml,加入聚苯乙烯反应板中每孔100 ul,加盖后放4℃过夜。
  (2)倾去孔内液体,加入洗涤液后静置3 min,倾尽洗涤液,重复洗涤3次。
  (3)将反应板口在吸水纸上,以除尽液体。
  2.  封闭:每孔加入200 ul封闭液,37℃孵育60 min,然后洗涤3次。
  3.  加入待测血清,37℃温育1~2 h,洗涤3次。用稀释液作对照孔,标准曲线的制备是用不容稀释度的纯GST-π。
  4.  加酶标抗体:按要求稀释抗GST-π-IgG-HRP,每孔100 ul,37℃温育1 h,然后洗涤5次,扣在吸水纸上吸干水分。
  5.  显色:加入TMB应用液,置室温反应15~30 min,加入50 ul 2 mol/l H2SO4,稳定3~5 min,即可比色。
  6.  还原型谷胱甘肽比色:用酶标仪,以PBS-T孔为对照,波长450 nm,测各孔光吸收度(A),查标准曲线,即可测得GST-π含量。
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